Selección y uso de Solventes en cromatografía HPLC
La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.
La fase móvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando se trata de una
mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una
proporción determinada y realice la mezcla en una cámara de mezclado.
Dependiendo de la forma en que se usa el solvente tenemos dos métodos:
Cuando durante toda la separación se utiliza siempre el mismo solvente, se denomina isocrática, sin embargo es normal realizar un gradiente de composición del solvente a lo largo de la cromatografía para mejorar la eficiencia y acortar la duración del proceso. Estos gradientes de solvente también son realizados en forma automatica por las bombas.
- Método de Gradiente de Elución.
Es un término que se utiliza para describir el proceso mendiante el cual se cambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:
- A baja presión
- A alta presión
Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener presente dos objetivos:
- Obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor tiempo posible.
- Asegurar alta precisión y exactitud.
Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir cinco pasos fundamentales:
- Determinar la composición inicial y final del solvente
- Ajustar el tiempo del gradiente
- Determinar la forma del gradiente (lineal, cóncava o convexa)
- Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolución
- Regresar a las condiciones iniciales la columna.
La bomba envía al solvente a través de caños de diámetro pequeño, generalmente de acero
inoxidable, hacia la válvula inyectora. Esta consiste en una válvula de varias vías que permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado.
Luego de que se produzca la separación en la columna, los componentes de la mezcla pasan
por el detector. Este produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia y esa
señal es enviada al registrador que realiza un gráfico de intensidad en función del tiempo
(cromatograma). Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. El integrador calcula además el àrea correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia.
Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es posible recuperar los productos que salen de él. De esta manera, dependiendo del tamaño del loop de inyección y de la columna, y del tipo de bomba, es posible realizar además de separaciones analíticas, cromatografías preparativas.
Criterios para la elección del solvente:
- Disponible comercialmente
- Precio
- Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad de pureza cromatográfica. Bajo contenido de impurezas.
- Disolver la muestra
- Misible con otros solventes para formar mezclas útiles
- No degradar o disolver la fase estacionaria
- Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión
- Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia óptica (cuando se usan detectores UV)
- Filtración y Desgasificación de solventes
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