¿Qué
son los pirógenos?
El
descubrimiento de que la inyección de soluciones
acuosas a un paciente podía causar fiebre, data
de 1876.
Los
agentes responsables de este incremento en la temperatura
fueron llamados "pirógenos". Más
adelante se descubrió que varias sustancias presentes
en el agua podían causar efectos pirogénicos.
Los
pirógenos más comunes son endotoxinas
(ET), por ejemplo lipo-poliscáridos (LPS) que
provienen de fragmentos de la pared celular de bacterias
Gram-negativas.
Efectos fisiológicos de los pirógenos
en humanos
Se
ha observado cierta diversidad de efectos, así
como una dependencia de los mismos a la dosis administrada.
En
general los pirógenos elevan los niveles de citosinas
inflamatorias circulantes, seguido de eventos clínicamente
relevantes como fiebre, hipotensión, linfopenia,
neutrofilia, niveles elevados de cortisol de plasma
y proteínas de fase aguda.
Bajas
dosis de pirógenos inducen reacciones inflamatorias,
sin síntomas clínicamente significativos.
Dosis
moderadas de pirógenos inducen fiebre y cambios
significativos en la composición del plasma.
La
administración de altas dosis de pirógenos
puede llevar a choques sépticos, caracterizados
por una disfunción cardiovascular, incluyendo
la depresión y dilatación del miocardio,
la vasodilatación, vasoconstricción, disfunción
del endotelio y disfunción de órganos
(riñón, hígado, pulmones y cerebro)
seguido de la falla de múltiples órganos
y muerte.
Las
células endoteliales juegan un rol muy importante
en la regulación de la hemostasis manteniendo
una barrera antitrombótica. El daño celular
de las células del endotelio debido a endotoxinas
es una implicación de la patogénesis de
los choques sépticos, dado que estas células
cambian como respuesta al estímulo pirogénico
y desarrollan propiedades protrombóticas (alterando
la regulación de la trombomodulina, la adherencia
de leucocitos y la proliferación y reparación
de si mismas, entre otras funciones importantes). La
información disponible sugiere que los LPS causan
daños irreversibles al endotelio.
Adicionalmente,
la introducción intravenosa de LPS en humanos
sanos suprimió la respuesta de la citosina en
ciertos experimentos in vitro que confirmaron que la
síntesis reducida de citosina no fue debida a
la tolerancia de la ET, sino a una verdadera reacción
de supresión inmunológica.
Pirógenos y aplicaciones de laboratorio:
En
vista de que los niveles de pirógenos en agua
pueden variar dramáticamente y de que su presencia
puede afectar los resultados de experimentos bioquímicos
y biológicos (además de los mencionados
efectos en pacientes), se han establecido niveles máximos
aceptables para contaminantes pirogénicos en
agua de laboratorio en estándares ASTM relativos
a agua purificada para aplicaciones de laboratorio.
En
algunos casos, incluso niveles pequeños de pirógenos
pueden alterar dramáticamente los resultados
de pruebas biológicas. Este impacto negativo
de los pirógenos en agua ha sido demostrado en
varios experimentos científicos:
Ø
Cultivo de células de mamíferos:
Debido a su naturaleza, las endotoxinas interactúan
con las membranas celulares y tienen efectos mayúsculos
en las funciones y crecimiento celular. Estos efectos
pueden ser causados por la inserción de LPS en
la membrana celular, su adhesión a receptores
celulares o a proteínas solubles. Ha sido demostrado
que el uso de agua libre de pirógenos en los
medios para cultivo celular optimiza la viabilidad celular
y su crecimiento.
Ø
Fertilización in vitro:
El uso de agua ultrapura, libre de pirógenos
en la preparación de medios y buffers con lleva
un mejor desarrollo del embrión y mayores tasas
de fertilización.
Ø
Electroforesis:
El agua utilizada para la preparación de reactivos
y el enjuague del equipo debe estar libre de pirógenos
y otras sustancias orgánicas que podrían
afectar adversamente la polimerización de geles
o bien la precisión del enfoque isoeléctrico,
con lo que pondrían en riesgo la precisión
y reproducibilidad de resultados experimientales
Ø
Biología molecular:
Técnicas experimentales sensibles, como la PCR,
clonación o producción de anticuerpos
monoclonales, requieren del uso de agua ultrapura y
libre de contaminantes inorgánicos y orgánicos
(como pirógenos y ácidos nucléicos).
"Reactividad" y estructura de los
pirógenos
Los
LPS tienen dos partes principales: una cadena polisacárida
hidrofílica con regiones antigénicas,
y un grupo lípido hidrofóbico. Dado que
la longitud de la cadena polisacárida es variable,
el peso molecular de los LPS en sus formas más
comunes va de 5,000 a 25,000 daltons.
Estas
moléculas son muy estables y pueden soportar
temperaturas de 120°C por periodos de hasta 3 horas.
También son bastante insensibles a cambios de
pH, por lo que se requieren altas concentraciones de
ácidos o bases para destruiras en un periodo
razonable.
En
agua, las moléculas de LPS pueden formar agregados
de diferentes tamaños, dependiendo de las condiciones
del medio:
Ø En presencia de surfactantes, las ET se
rompen en monómeros con pesos moleculares de
entre 5,000 y 25,000 Da.
Ø
En disoluciones que contienen cationes monovalentes
o divalentes, los LPS forman micelas de alto peso molecular
(mayor de 300,000 Da) con cadenas de polisacárido
hidrofílicas en la superficie de cada micela
Ø
En agua ultrapura, de alta resistividad, se forman incluso
agregados mayores, permitiendo la remoción eficiente
de los LPS por membranas de ósmosis inversa y
ultrafiltración.
Medición de Pirógenos en Agua
En
un inicio, la presencia de pirógenos en agua
y disoluciones acuosas se probaba inyectando la disolución
problema a conejos y esperando para observar si se presentaban
signos de fiebre. Desde entonces, se han desarrollado
métodos más sensibles, particularmente
gracias al descubrimiento de que una fracción
de la sangre del cangrejo , llamada lisato de limulus
amebocita (conocida como LAL por su nombre en inglés:
Limulus amebocyte lysate) reacciona con los LPS como
agente coagulante.
Hoy
en día un método cinético turbidimétrico
LAL sensible, ofrece un límite de detección
de 0.001 EU/mL.
Producción de agua ultrapura apirogénica:
Dos
métodos comunes para producir agua libre de pirógenos
son la ósmosis inversa y la ultra filtración
(UF).
Para
la ultra filtración se requiere de una membrana
con un límite de peso molecular nominal (NMWL
de su nombre en inglés) suficientemente bajo
para lograr la remoción eficiente de endotoxinas.
Las
membranas de polisulfona de fibra hueca son compatibles
con valores altos de pH y como resultado, pueden ser
sanitizadas con NaOH, el único agente limpiador
que destruye eficientemente a los pirógenos a
través de una reacción de hidrólisis.
Estas membranas tienen un NMWL de 5,000 Da, lo que en
condiciones normales permite una remoción eficiente
de endotoxinas. Experimentos han demostrado que un cartucho
de UF con este tipo de membranas usado adecuadamente
puede reducir niveles de 40,00 EU/ml de ET en 100,000
veces.
Problemas existentes y reflexiones recientes
Cada
vez existen más estudios que confirman que los
LPS son sumamente heterogéneos y su tamaño
varía en función de las condiciones, por
lo que el rango completo de su peso molecular está
entre <1,000 Da y varios millones de Da. Esta información
incrementa la incertidumbre en el desarrollo de métodos
efectivos para remover LPS y hace que sea importante
hacer las siguientes reflexiones:
Entre
los LPS, algunos que se encuentran comúnmente
tienen un radio de Stokes menor que el de la endotoxina
purificada, que es la que se utiliza típicamente
para calificar los filtros.
En
el experimento de introducción intravenosa de
LPS en humanos sanos (mencionado anteriormente) la síntesis
de citosina en monocitos no regresó a sus niveles
normales de control ni siquiera en 24 horas, que fue
la duración del experimiento. Esta observación
es sumamente interesante dado lo pequeño de la
dosis de LPS usada (3 ng/kg, o bien 30 EU/kg de peso
corporal), así como el hecho de que el estándar
actual de endotoxina para
